第5章 資料
第2節 遺伝
第7項 制限酵素
制限酵素
制限酵素はその種類によりＤＮＡ上の4〜6塩基の特定の配列を認識してその中の特定の場所を切る。
1970年に発見され、本来は侵入してきた外来ＤＮＡを切断して排除するために細菌がもつ秘密兵器。
例えば
ecor[1](エコーアールワン)という制限酵素は、
DNA上のGAATTCという配列のみを認識して、GとAの間で切断する。
ecor[1]は抽出された細菌の学名の頭文字に由来する。
大腸菌(escherichia coli)の抵抗性(r)株の最初に見つかったもの。
6塩基を認識する制限酵素は平均4000塩基(4の6乗)に1回の割合でDNAを切る。
1個の細胞の2コピーのゲノムから100万個以上のDNA断片ができる。
同じ長さのDNA断片があれば、電気泳動すると同じ位置にくる。
それをサザンブロット(southern)という技術で、
目的とする断片だけにアイソトープが着くようにし、
最終的にはレントゲンフィルム上の黒い線として検出する。
1975年E・M・サザン
hae[3](ヘースリー) 5'-g-g-↓-c-c-3'
-c-c-↑-g-g-
hha1(エイチハーイチ) -g-c-g↓c-
-c↑g-c-g-
bamn1(バムエヌワン) -g↓g-a-t-c-c-
-c-c-t-a-g↑g-
pst[1](プストワン) -c-t-g-c-a↓g-
-g↑a-c-g-t-c-
hae[3](ヘモフィルスインフルエンザバクテリアの3番目)
頻度
塩基5千個程度のウイルスのDNAが均等でアトランダムとすると、
4塩基では4の4乗に1回(約250回に1回)だから、5千塩基では10〜20回、
6塩基では4の6乗に1回(約4千回に1回)だから、5千塩基では1回程度となる。
環状DNAの場合
6塩基では1回切断、4塩基では10〜20回切断
ゲル電気泳動によるDNA断片の分離
ガラス板2枚の間にゲル
アクリルアミド+重合剤
↓
ポリアクリルアミド
又はアガロース
ゲルになる
DNAより大きい網のような構造の巨大な分子
小さいDNAほどゲルの網目を速く移動できる
hind[2](ヒンドゥツー) alu[1]
-
原点
+
濃い砂糖液と混ぜる
ph7の緩衝液
リン酸基がマイナスだからプラスへ動く
短い方が速い
バンドができる
そのままでは見えないから検出する技術が必要
ディテクション(detection)
染色する
紫外線をあてる
ラジオアイソトープでx線フィルム上に写す
エチジウム・ブロミドを混ぜ紫外線を当てると
オレンジ色の強い蛍光を発す
260nm付近の波長のUVをもっともよく吸収する
32Pをリン酸に入れる(atp,gtp)
ヌクレオチドキナーゼという酵素で5'端に印をつける
数十〜400塩基くらいを一度に分析
5'端 切断
○----------↓-----
----------↓-----○
○----------
----------
-----
-----○
印のついた方を調べる
アデニンを修飾する場合
○--a--a-a--a--a--a-
印
おだやかな条件で反応させ
分子ごとに6つのaのどれか一カ所が修飾されるようにする
修飾した場所はアルカリなどで簡単に切れる
○--a--a-a--a--a--a-
↑
ここを修飾したとすると
○--a--a-a--a--a-
修飾したaの前で切れる
○--a--a-a--a--a-
○--a--a-a--a-
○--a--a-a-
○--a--a
○--a-
○-
いろいろな長さができるからバンドで調べる
このとき一本鎖DNAは水素結合を作るとまるまってしまうから
尿素を加えまるまらないようにする
マクサム・ギルバード法による塩基配列分析
AGCTのそれぞれで切ったもの
(Tで切るのは実際はTとCで切ったことになる)
を一緒に並べ
バンドの位置などから配列を読んでいく
- +
t
c
g
a
3' ｜｜｜｜｜｜ 5'
tctaaa
↑
多い方でt
このように配列を読んでいく
連結酵素＜−＞制限酵素